GmFad 2-1 был помещен под контроль сильного семяспецифичного промотора, полученного от αʹ- субъединицы β- конглицинового гена соевого боба (Glycine max). Этот промотор допускает высокий уровень семя-специфичной экспрессии гена признака. Он продолжает 606 пар нуклеотидов выше избранного участка цепи ДНК исходного кодона αʹ- субъединицы β- конглицинового исходного белка Glycine max. β- конглициновая промоторная последовательность представляет собой аллель β- конглицинового гена (Doyle et al., (1986) у J. Biol. Chem., 261:9228-9238), имеющую различия по 27 нуклеотидным позициям. Как было показано, она поддерживает семяспецифический характер экспрессии трансгенных растений (Barker et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:458-462 и Beachy et al., (1985) EMBO J 4:3047-3053). Рамка считывания оканчивается 3'-фрагментом от фазеолинового зеленого боба (Phaseolus vulgaris). Имеется 1174 пар нуклеотидов фрагмента секвенирования последовательности 3' Phaseolus vulgaris фазеолинового генного стоп-кодона (происходящего от клона, описанного Doyle et al., 1986).

Открытая рамка считывания GmFad 2-1 (ОРС) находилась в чувствительной ориентации в отношении промотора, так чтобы продуцировать ген, нефункционирующий в плане GmFad 2-1 кДНК и эндогенный GmFad 2-1 ген. Это явление, известное как "чувствительная супрессия", является эффективным способом преднамеренного выключения генов в растениях и описан в патенте США N 5,034,323.

Для поддержания и репликации плазмиды в E.coli транскрипционную единицу GmFad 2-1, описанную выше, клонируют в плазмиду pGEM-9z(-) (Promega Biotech, Madison WIO, USA).

Для идентификации трансформированных растений сои использовали ген β- глюкуронидазы (GUS) от E.coli.

Использованная кассета состояла из трех модулей: промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, гена β- глюкуронидазы ген (GUS) от E.coli и 0.77 тысяч пар нуклеотидного ДНК фрагмента, содержащего ген-терминатор от гена нопалин синтазы (NOS) Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Промотор 35S представляет собой 1.4 тысяч пар нуклеотидную область CaMV для нерегулируемой экспрессии генов в большинство тканей растений (Odell et al., (1985) Nature, 303: 810-812), ген GUS является 1.85 тысяч пар нуклеотидным фрагментом, кодирующим фермент β- глюкуронидазу (Jefferson et al., (1986) PNAS USA 83:8447-8451), а терминатор NOS является долей 3'-конца кодирующей области нопалин синтазы (Fraley et al., (1983) PNAS USA 80:4803-4807). Кассета GUS была клонирована в конструкцию GmFad 2-1/pGEM-9z(-) и была обозначена как pBS43.

Плазмида pBS43 была трансформирована в меристему элитной линии сои A2396 путем бомбардировки частицами (Christou et al., (1990) Trends Biotechnol. 8: 145-151). Продуктивные растения были регенерированы с использованием способов, хорошо известных в данной области.

Из первоначальной популяции трансформированных растений было выращено растение, которое проявляло GUS активность и которое также было положительным в отношении GmFad 2-1 гена (событие 260-05) при оценке полимеразной реакции синтеза цепи. Небольшие стружки были взяты от ряда семян R1 растения 260-05 и исследованы на состав жирных кислот. Семена, от которых была взята стружка, были высажены и пророщены. Геномная ДНК была экстрагирована из листьев конечных растений и вырезана ферментом рестрикции BamHI. Блоты были исследованы на фазеолиновую пробу.

Из рамки ДНК гибридизации было ясно, что при первоначальном случае трансформации GmFad 2-1 конструкция была интегрирована в два различных локуса генома сои. В одном локусе (Локус A) конструкция GmFad 2-1 приводила к нефункционированию эндогенного гена GmFad 2-1, приводя в конечном результате к относительному содержанию олеиновой кислоты приблизительно в 85% (по сравнению с примерно 20% в элитных сортах сои). В локусе A было две копии pBS43. На ДНК гибридизационном блоте были видны две сорасходящихся зоны. В другом локусе интеграции (Локус B) GmFad 2-1 был сверхэкспресирующим, уменьшая таким образом содержание олеиновой кислоты до примерно 4%.

Четвертое поколение изолированной линии (растения R4), генерированной из первоначального трансформанта, оставили расти до зрелости. Семена R4, которые содержали только нефункционирующий Локус A (например, G94-1), не содержали каких-либо обнаруживаемых м-РНК GmFad 2-1 (при измерении путем нозерн-блоттинга) в образцах, полученных через 20 дней после цветения. GmFad 2-2 мРНК хотя и несколько уменьшился по сравнению с контролем, но не подавлялся. Таким образом, чувствительная конструкция GmFad 2-1 имела требуемое влияние на предотвращение экспрессии GmFad 2-1 гена и, следовательно, увеличивала содержание олеиновой кислоты в бобах. Все гомозиготные для GmFad 2-1 нефункционирующего локуса растения имели идентичный саузерн-блот профиль в ряду поколений. Это показывает, что введение было стабильным и в одно и то же положение генома по крайней мере в четырех поколениях. Сводка по содержанию олеиновой кислоты, обнаруженной в различных поколениях рекомбинантных растений сои и бобах, представлена в таблице 1.

Пример 2

Экстракция и переработка высокоолеинового соевого масла. Каждое высокоолеиновое и обычное соевые масла были получены на лабораторных или коммерческих пилотных установках с использованием промышленных стандартных способов, как описано ниже. Коммерческие образцы других высокостабильных масел и шортенингов, используемые для сравнения, были получены от производителей и хранились замороженными в атмосфере азота. Они включали образцы соевого масла для жарки, прозрачного жидкого шортенинга, шортенинга для работы в тяжелых условиях, низко линоленового соевого масла и высокоолеинового канолового масла. Высокоолеиновое кукурузное масло было получено с использованием промышленных стандартных условий, подобных тем, что описаны выше.

Часть A: Крупномасштабная (пилотная установка) переработка масла.

Собранные соевые бобы (97.5 кг) подвергали гидротермической обработке путем обрызгивания семян водой для увеличения влажности до 8.7%. Воду и бобы перемешивали в течение примерно 10 мин и оставляли доходить до равновесия на приблизительно 21 час. Обработанные водой бобы лущили с использованием дробильного вальцового станка Ferrell-Ross при значении 3,5 на дробильно-вальцовой шкале. Шелуху отделяли на мультиаспираторе Kice модели 6F6 с использованием дифференциального давления воздуха, равном 0,8-1,2 дюймов (~ 20,3-30,5 мм) воды. Аспирированную соевую мякоть варили в течение 10-30 мин в двухемкостном варочном котле Simon-Rosedowns, нагретом до примерно 40oC. Нагретую мякоть сои пересыпали во вторую емкость и нагревали при 60-75oC в течение 15-25 мин. Сваренную мякоть соевых бобов плющили до толщины приблизительно 0,4 мм на плющильном вальцовом станке E.R. and F.Turner. Конечные соевые хлопья экстрагировали гексаном в экстракторе Crown Iron Works Loop (тип II) с использованием общего времени удерживания 60 мин и соотношения растворитель:твердая масса, равном приблизительно 1,5:1 (вес.:вес.) Температура растворителя составляла 50-60oC. Из смеси (смесь гексан/масло) удаляли растворитель с использованием поверхностного шнекового теплообменника Tetra-Laval с последующим полным удалением растворителя в лаборатории с использованием роторного испарителя. Сырое масло собирали и хранили под азотом до последующей переработки.

Сырое масло рафинировали водой следующим образом. Масло нагревали до 60-70oC и добавляли объем воды с температурой 90oC, эквивалентный 2% от объема масла, и перемешивали в течение 15 мин при 75-80oC; твердые вещества затем отделяли путем центрифугирования. Качество рафинированного масла повышали путем нагревания до 70-80oC. Добавляли объем 85%-yого раствора фосфорной кислоты, эквивалентный 0.1% объема рафинированного масла, и перемешивали раствор в течение 30 мин. Добавляли достаточное количество NaOH для достижения 16 градусов ареометра Боме, чтобы нейтрализовать свободные жирные кислоты; дополнительно добавляли 0.08% вес/вес избыток NaOH и раствор перемешивали при нагревании при 80-85oC. Твердые вещества отделяли путем центрифугирования. Масло промывали водой путем нагревания до 75-80oC и добавления до 10% (об/об) воды с температурой 95oC, перемешивания в течение 10 мин при 80-90oC и центрифугирования. Промытое водой масло осветляли путем загрузки 1200 г масла в 2-литровый реактор Парра и добавления под вакуумом осветляющей глины (Clarion 470 SA; Ammerican Colloid Co.) до 0.5% (вес/вес), нагревания до 110oC в течение 30 мин перед охлаждением до 65oC. Масло удаляли и добавляли 30 г "фильтровальной вспомогательной добавки" и масло отфильтровывали. Эти стадии повторяли до тех пор, пока все масло не обесцветили. Масло дезодорировали путем загрузки 2200 г в 5 л стеклянный дезодоратор под вакуумом и нагревания до 100oC. Пар добавляли 3% (вес/вес)/ч и масло доводили до 240oC с постоянным барботированием в течение 1 ч при этой температуре. Затем масло охлаждали до 70oC при барботировании и масло удаляли из дезодоратора. Добавляли тридцать частей на миллион лимонной кислоты, чтобы имитировать промышленные стандарты во время дезодорирования. Дезодорированное масло хранили в замороженном виде под азотом.

Часть B: Переработка масла в небольшом (лабораторном масштабе)

Собранные соевые бобы нагревали в микроволновой печи до 180oF (82,2oC), охлаждали до комнатной температуры и лущили с использованием лущильно-вальцового устройства Roskamp TRC 650-6. Шелуху соевых бобов удаляли, используя аспиратор Kice и оставшуюся мякоть нагревали до 180oC и плющили на плющильно-вальцовом устройстве Roskamp TRC 912. Сырое масло экстрагировали в стеклянном экстракционном устройстве с водяной рубашкой, нагреваемом до 60oC в течение 45 мин, с использованием соотношения растворителя к твердой массе, равном приблизительно 4: 1. Смесь гексан/масло собирали и повторяли экстракцию. Смесь освобождали от растворителя с использованием роторного испарителя с получением сырого масла.

Добавляли объем 85%-ного раствора фосфорной кислоты, равный 0.1% (об/об) объема сырого масла, и раствор нагревали до 65-70^oC в течение 10 мин при перемешивании. Теплый (60^oC) NaOH (8% водный раствор) добавляли к маслу по каплям, для нейтрализации свободных жирных кислот и H₃PO₄ с дополнительным избытком 0.2% вес/вес Раствор перемешивали в течение пяти мин и твердые вещества отделяли путем центрифугирования. Масло промывали водой путем добавления горячей воды до 20% (об/об) к образцу, нагретому до 90^oC, при быстром перемешивании. Масло и воду оставляли охлаждаться при комнатной температуре в течение 10 мин и затем отделяли посредством центрифугирования. Масло дегидратировали с использованием очень быстрого перемешивания под вакуумом при 85-95^oC в течение 30 мин или до тех пор, пока вся влага (пузырьки, конденсат) не была удалена. Вакуум снимали азотом. Масло обесцвечивали путем добавления 2% (вес/вес) активированной обесцвечивающей земли (AOCS#Z1077) и раствор перемешивали в вакууме в течение 30 мин при 85-95^oC перед охлаждением до 80^oC. Вакуум снимали азотом и добавляли 1% (вес/вес) диатомовой земли, и смесь фильтровали через приготовленный слой диатомовой земли. Добавляли приблизительно до 50 ч. на миллион лимонной кислоты и масло дезодорировали при 240^oC паром (4 мл воды на 100 г масла) в стеклянном дезодораторе в течение приблизительно 1 ч. Масло охлаждали до 80^oC при барботировании и далее охлаждали до 40^oC под азотом. Рафинированное, обесцвеченное и дезодорированное масло хранили замороженным в атмосфере азота.